實驗動物細菌學監(jiān)測標準操作規(guī)程

主體內容：

1. 標本的采集

正常動物細菌檢測主要檢查呼吸道和腸道，分別取氣管分泌物及腸內容物做細菌培養(yǎng)檢查。對于發(fā)病動物，采取其病變組織和臟器做細菌學檢查。

2. 細菌的培養(yǎng)

細菌是單細胞的原核生物，絕大部分都可以在人工培養(yǎng)基上進行繁殖，只有少數(shù)例外，如泰澤病原體需在活細胞中繁殖。不同細菌種類所要求的zui適生長條件不盡相同，有些細菌需在有氧的環(huán)境下才能生長，稱為需氧菌；有些只能在無氧環(huán)境下生長，稱為厭氧菌；還有一些細菌在有氧、無氧環(huán)境下都可以生長，稱為兼性厭氧菌。

培養(yǎng)細菌的目的，是從不純的被檢材料中找出特定的細菌或全部細菌，這一過程稱為分離培養(yǎng)。如果只是培養(yǎng)性質明確的一種細菌，則稱為純培養(yǎng)。為了從被檢材料中分離出所要檢查的細菌，可以利用多種性質不同的選擇性培養(yǎng)基，檢查各種不同的目的細菌。

（1）培養(yǎng)基的種類：按物理性狀可把培養(yǎng)基分為液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基三種。

（2）細菌培養(yǎng)的方法：培養(yǎng)細菌的目的不同，其方法也不盡相同，通常把細菌的培養(yǎng)方法分為一般培養(yǎng)法、二氧化碳培養(yǎng)法和厭氧培養(yǎng)法三種：

①一般培養(yǎng)法 一般培養(yǎng)法又稱需氧培養(yǎng)法，將已接種好的平皿、斜面或液體培養(yǎng)基等，置于37℃孵育箱內培養(yǎng)18～24h，一般細菌即可于培養(yǎng)基上生長。但也有少數(shù)生長緩慢的細菌，需培養(yǎng)2～7d甚至更長時間才能生長。

②二氧化碳培養(yǎng)法 某些細菌如腦膜炎奈毖氏菌、布魯桿菌及肺炎支原體等，需要在一定的二氧化碳環(huán)境下才能良好生長，即二氧化碳培養(yǎng)法，常用的有二氧化碳培養(yǎng)箱、燭缸法、重碳酸鈉—鹽酸法。

③厭氧培養(yǎng)法 有些細菌只能在無氧環(huán)境下生長，即厭氧培養(yǎng)法，目前常用的厭氧培養(yǎng)法有厭氧罐法、氣袋法及厭氧箱等。

3. 細菌的鑒定和分類

把獲得純培養(yǎng)的細菌進行一系列生物學特性的檢查，并確定其分類學上的位置，這個過程叫細菌鑒定。細菌生物學性狀包括菌落形態(tài)、菌體形態(tài)、染色性質、生化反應以及血清學反應特性和特異性噬菌體等。

細菌的分類是根據(jù)其營養(yǎng)方式及各種生物學特性親緣關系，將細菌劃分為不同的門、綱、目、科、屬、種，其基本分類單位是種。

（1）菌落形態(tài)：菌落的特征是識別細菌的重要依據(jù)，觀察菌落特征時應注意：邊緣是整齊的、還是鋸齒的，表面是光滑的、還是粗糙的，中間是突起的、還是凹陷的，是透明的、還是半透明或不透明的。如乙型溶血性鏈球菌，在血瓊脂平皿上，菌落灰白色，圓形，中央稍凸起，透明或半透明，表面光滑，菌落周圍可見透明的溶血環(huán)。而綠膿桿菌，在選擇性培養(yǎng)基（NAC）上菌落扁平，邊緣不整齊，大小不一，表面濕潤、有光澤，菌落周圍有藍綠色或褐色色素擴散，但也有不產生色素的菌株。這些菌落特征在細菌的鑒定中均有一定意義。

（2）細菌的生化反應特性：各種細菌具有各自*的酶系統(tǒng)，因而在代謝過程中所產生的分解與合成代謝產物也不同。這些代謝產物又各具不同的生化特點。根據(jù)此特點，利用生物化學方法來鑒別不同細菌，稱為細菌的生化反應試驗。生化反應試驗方法很多，主要有以下幾種：

①糖（醇）類發(fā)酵試驗：是鑒定細菌的生化反應試驗中zui主要的試驗，不同細菌可發(fā)酵不同的糖類，如沙門菌可發(fā)酵葡萄糖，但不能發(fā)酵乳糖，大腸桿菌則可發(fā)酵葡萄糖和乳糖；即使兩種細菌均可發(fā)酵同一種糖類，其發(fā)酵結果也不盡相同，如志賀菌和大腸桿菌均可發(fā)酵葡萄糖，但前者僅產酸，而后者則產酸、產氣，故可利用此試驗鑒別細菌。

②葡萄糖代謝類型鑒別試驗：可用于葡萄球菌與微球菌的鑒別。

③β-半乳糖苷酶試驗（ONPG）：分解乳糖的細菌ONPG試驗為陽性，如埃希氏菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬和沙雷氏菌屬等。而不發(fā)酵乳糖的細菌如沙門菌、變形桿菌和腸桿菌科中其他不發(fā)酵乳糖的細菌ONPG試驗均為陰性。

④其他生化試驗：如淀粉水解試驗、七葉苷水解試驗、甲基紅試驗及VP試驗等。

（3）革蘭氏染色法：染色除能觀察細菌形態(tài)外，還可根據(jù)其染色反應，將細菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌兩大類。如沙門菌屬、志賀菌屬、巴斯德桿菌及耶爾森菌等均為革蘭氏陰性菌，革蘭氏陽性菌有肺炎鏈球菌、單核細胞增生性李斯特桿菌、金葡萄球菌、鼠棒狀桿菌等。

（4）血清學鑒定：除生化鑒定外，必要時可進行血清學鑒定。如沙門菌屬、志賀菌屬、綠膿桿菌、耶爾森菌等均可做血清學分型試驗。

根據(jù)送檢動物的不同級別，對所需檢查的病原菌進行逐項排查，zui后得出檢測結論。